一株植物乳杆菌dt88及其在制备微塑料吸附、株植作方清除的物乳产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株植物乳杆菌
dt88
及其在制备微塑料吸附
、杆菌
清除的株植作方产品中的应用
。
背景技术：
2.由塑料制品产生的物乳塑料垃圾在环境中被分解成微小颗粒
。
通常，杆菌粒径小于
5mm
的株植作方塑料颗粒为微塑料
(mps)
，其中粒径小于
0.1
μm的物乳塑料颗粒为纳米塑料
(nps)。
微塑料广泛存在于空气
、杆菌
水体
、株植作方
土壤中，物乳可被浮游生物
、杆菌
鱼类
、株植作方
鸟类等摄食，物乳经食物链最终进入人体，杆菌不仅造成环境污染，同时也对人类健康构成潜在威胁
。
大量研究已证实，微塑料可对啮齿动物
、
水生生物的消化系统
、
呼吸系统
、
免疫系统
、
神经系统以及生殖系统造成损害，累积在组织中的微塑料不能被清除，可造成活性氧大量增加，引起氧化应激，产生毒性作用
。
因此，排出体内微塑料
、
降低微塑料含量，对人类健康具有重要意义
。
3.目前尚未见任何关于能够清除人体内微塑料的方法的报道
。
使用生物方法降低环境和水体中塑料污染的方法有少许报道，例如，一些细菌和真菌被报道具有降解塑料的能力，它们通过分泌角质酶
、
蛋白酶
、
酯酶
、
脂酶等，将多聚体分解为单体或低聚体
。
此外，还有一些具有捕获
、
吸附微塑料能力的细菌，这些细菌能够附着在微塑料表面并生成粘性生物膜，这种粘性基质可以捕获游离微塑料，导致微塑料生物聚集，从而实现微塑料的分离和清除
。
然而，目前已报道的能够降解或吸附微塑料的细菌
、
真菌均为不可食用微生物，而且在水体等环境中吸附微塑料的细菌通常需要较长时间形成吸附微塑料的生物膜，同时此类细菌较难耐受胃肠道环境
。
因此，上述方法难以用于人体微塑料清除
。
技术实现要素：
4.本发明提供一株植物乳杆菌
dt88
及其在制备微塑料吸附
、
清除的产品中的应用
。
5.本发明提供植物乳杆菌
(lactiplantibacillus plantarum)dt88
，该菌株于
2023
年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心
(guangdong microbial culture collection center,gdmcc
，地址：广东省广州市先烈中路
100
号大院
59
号楼5楼，邮编：
510070)
，分类命名为
lactiplantibacillus plantarum
，保藏编号为
gdmcc no
：
63626。
6.本发明中，植物乳杆菌
dt88
菌株分离自鱼茶，通过细菌形态学
、
生理学以及
16s rrna
测序对该菌株进行鉴定，结果为植物乳杆菌
(lactiplantibacillus plantarum)
，命名为植物乳杆菌
dt88。
7.植物乳杆菌
dt88
具有以下微生物学特性：
8.(1)
形态学特征
9.革兰染色呈阳性，光镜下细胞呈杆状，两端为圆形，单个细胞或成对
、
成链排列
。
10.在
mrs
固体培养基中培养
24h
后，形成圆形
、
凸出
、
边缘整齐光滑
、
表面湿润的乳白色菌落
。
11.(2)
生理特性
12.植物乳杆菌
dt88
能在酸性或含胆盐培养基中生长
。
该菌株能有效吸附微塑料，吸附率达到
79
％
。
植物乳杆菌
dt88
具有抗氧化效果，能降低微塑料带来的氧化损伤
。
13.植物乳杆菌
dt88
可采用以下培养方法进行培养：将植物乳杆菌
dt88
接种于
mrs
肉汤培养基中，
37℃
厌氧培养
24h。
其中，
mrs
肉汤培养基的成分为：酪蛋白酶消化物
10.0g/l、
牛肉粉
10.0g/l、
酵母粉
4.0g/l、
柠檬酸三铵
2.0g/l、
乙酸钠
5.0g/l、
硫酸镁
0.2g/l、
硫酸锰
0.05g/l、
葡萄糖
20.0g/l、
磷酸氢二钾
2.0g/l、
吐温
80 1.0g/l
，
ph 5.7
±
0.2
，固体培养基加入
1.5
％琼脂
。
14.植物乳杆菌广泛存在于发酵食品中，在食品工业中常作为发酵剂或防腐剂使用
。
植物乳杆菌已被列入可用于食品的菌种名单中，在欧盟食品安全局
(efsa)
颁布的欧盟微生物菌种安全资格认证
(qps)
名单中，也获得了美国食品药品监督管理局
(fda)
的
gras(generally recognised as safe)
认证，在全球广泛应用于各种益生菌食品和膳食补剂中，基因组研究数据
、
小鼠实验和人体临床实验都证明了植物乳杆菌的安全性
。
15.本发明提供包含以上所述的植物乳杆菌
dt88
的微生物制剂
。
16.优选地，以上所述的微生物制剂中，植物乳杆菌
dt88
以活菌形式存在
。
17.以上所述的微生物制剂可为固体制剂
(
例如菌粉
)
或液体制剂
。
18.本发明提供以上所述的微生物制剂的制备方法，所述方法包括培养所述植物乳杆菌
dt88
的步骤
。
19.优选地，所述培养为在
35-37℃
条件下厌氧培养
。
20.优选地，所述培养采用
mrs
肉汤培养基进行
。
在培养结束后，收集菌液，进一步制备为微生物制剂
。
21.基于植物乳杆菌
dt88
的功能，本发明提供该菌株的下述任一种应用
。
22.本发明提供所述植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂在制备用于吸附微塑料和
/
或促进微塑料排出的产品中的应用
。
23.植物乳杆菌
dt88
具有较好的耐酸
、
耐胆盐特性，能够很好地耐受体内胃肠道环境，进而在体内发挥吸附微塑料
、
促进微塑料排出以及抗氧化的功效
。
24.上述应用中，所述产品优选为食品
、
药品或饲料
。
所述食品优选为保健食品
。
25.本发明提供所述植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂在环境中吸附和
/
或清除微塑料的应用
。
26.植物乳杆菌
dt88
在体外环境中也能够发挥吸附微塑料
、
促进微塑料清除的功能，可用于环境中微塑料的吸附和
/
或清除，例如水
、
土壤等
。
27.本发明提供所述植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂在制备抗氧化产品中的应用
。
28.植物乳杆菌
dt88
具有自由基清除能力，能够发挥抗氧化功能，减少微塑料导致的氧化损伤
。
植物乳杆菌
dt88
同时具有吸附微塑料和抗氧化的功能，一方面能够促进体内微塑料的排出，另一方面能够减少体内残留微塑料造成的氧化损伤，可从上述两方面有效降低微塑料积累对机体造成的不良影响
。
29.上述应用中，所述产品优选为食品
、
药品或饲料
。
所述食品优选为膳食补充剂或保健食品
。
30.本发明提供所述植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂在制备食品
、
药品或饲料中的
应用
。
31.本发明提供一种食品，所述食品包含以上所述的植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂
。
32.本发明提供一种药品，所述药品包含以上所述的植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂
。
33.本发明提供一种饲料，所述饲料包含以上所述的植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂
。
34.上述药品
、
食品
、
饲料除包含所述植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂外，还可包含药品
、
食品
、
饲料领域允许的原料或辅料
。
其中，药学领域允许的辅料包括填充剂
、
赋型剂
、
润滑剂
、
润湿剂
、
稀释剂等
。
药品的制剂类型可为固体制剂
(
例如粉剂
、
颗粒剂
、
胶囊剂
、
片剂等
)
或液体制剂
(
例如口服液等
)。
35.本发明提供一种微塑料吸附剂，所述微塑料吸附剂包含以上所述的植物乳杆菌
dt88
或所述微生物制剂
。
36.与现有技术相比，本发明提供的技术方案的有益效果至少包括：植物乳杆菌
dt88
具有较好的耐酸
、
耐胆盐能力，能够耐受胃肠道环境，具有作为食用益生菌的潜力；该菌株能够高效吸附微塑料，加速微塑料排出和清除，且具有抗氧化能力，能够降低微塑料积累造成的氧化损伤，有望开发为食用益生菌产品，作为人体内肠道菌发挥吸附微塑料
、
加速微塑料排出
、
降低微塑料损伤
、
保护胃肠道健康的功效
。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图
。
38.图1为实施例1中植物乳杆菌
dt88
在
mrs
培养基上的菌落形态图
。
39.图2为实施例1中植物乳杆菌
dt88
镜检图
。
40.图3为实施例2中植物乳杆菌
dt88
在酸性培养基中的存活率结果，其中，
ns
表示
p
值大于
0.05(
数据来自三次重复实验，误差线表示标准差
)
，统计分析方法为
t test。
41.图4为实施例3中植物乳杆菌
dt88
在含胆盐培养基中的存活率结果，其中，
ns
表示
p
值大于
0.05(
数据来自三次重复实验，误差线表示标准差
)
，统计分析方法为
t test。
42.图5为实施例4中植物乳杆菌
dt88
与溶液中
ps
荧光微球吸附凝集结果
。
43.图6为实施例4中植物乳杆菌
dt88
对溶液中
ps
荧光微球的吸附率结果，其中，
****
表示
p
值小于
0.0001(
数据来自三次重复实验，误差线表示标准差
)
，统计分析方法为
t test。
44.图7为实施例4中植物乳杆菌
dt88
和
ps
荧光微球吸附电镜图，放大倍数为
50000
倍
。
45.图8为实施例5中植物乳杆菌
dt88
对
dpph
的清除率结果，其中，数据来自三次重复实验，误差线表示标准差
。
46.图
3、
图
4、
图6中
control
代表对照
。
具体实施方式
47.为使本发明的目的
、
技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚
、
完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例
。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围
。
48.实施例1植物乳杆菌
dt88
的分离及鉴定
49.1、
植物乳杆菌
dt88
的分离及鉴定
50.1.1
样品来源
51.本发明的植物乳杆菌
dt88
分离自鱼茶
。
52.1.2
培养基的配制
53.样品分离所用的培养基为
bbl
培养基，植物乳杆菌
dt88
培养使用
mrs
培养基
。
54.bbl
培养基成分见表1，
mrs
培养基成分见表2，加入
1.5
％琼脂即为固体培养基
。
55.表
1bbl
培养基配方
[0056][0057][0058]
表
2mrs
培养基配方
[0059][0060]
1.3
菌株的分离
[0061]
将
1g
鱼茶样品放入
10ml
步骤
1.2
制得的
bbl
液体培养基中，混匀后于
36℃
下培养
24h
，然后在超净台中吸取富集液
1ml
，进行十倍梯度稀释，选取
10-4
、10-5
、10-6
、10-7
四个稀释梯度的菌液
100
μ
l
涂于含有无菌
bbl
固体培养基的培养皿上，于厌氧条件下
36℃
静置培养
48h-72h
，至有明显单菌落形成后，应用高通量自动化平台，从培养皿上自动挑取典型菌落到
bbl
液体培养基中培养，分离得到的菌株通过
16s rrna
测序确定种属信息
。
[0062]
2、
植物乳杆菌
dt88
的鉴定
[0063]
2.1
菌落特征
[0064]
植物乳杆菌
dt88
在
mrs
固体培养基中培养
24h
后，形成圆形
、
凸出
、
边缘整齐光滑
、
表面湿润的乳白色菌落，见图
1。
[0065]
2.2
显微镜下形态
[0066]
植物乳杆菌
dt88
菌落涂片：革兰染色呈阳性，光镜下细胞呈杆状，两端为圆形，单个细胞或成对
、
成链排列
。
见图
2。
[0067]
2.3 16s rrna
鉴定
[0068]
鉴定单位：擎科生物科技有限公司
。
[0069]
鉴定序列：如
seq id no.1
所示
。
[0070]
鉴定结果：将测序结果和
ncbi
数据库比对，比对结果和生理生化结果相结合，确定该菌株为植物乳杆菌
(lactiplantibacillus plantarum)。
[0071]
植物乳杆菌
(lactiplantibacillus plantarum)dt88
已于
2023
年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心
(guangdong microbial culture collection center,gdmcc
，地址：广东省广州市先烈中路
100
号大院
59
号楼5楼，邮编：
510070)
，分类命名为
lactiplantibacillus plantarum
，保藏编号为
gdmcc no
：
63626。
[0072]
实施例2植物乳杆菌
dt88
的耐酸能力检测
[0073]
人体胃环境中整体
ph
条件呈强酸性，因此，菌株的耐酸能力是评估其是否能在胃酸环境下存活
、
定植的重要指标
。
商业化菌株鼠李糖乳杆菌
lactobacillus rhamnosus gg
是目前被广泛使用的益生菌，耐酸能力强
。
[0074]
本实施例中，使用
ph
＝
2.5
的
mrs
培养基验证植物乳杆菌
dt88
的耐酸能力
。
取
1ml
的菌液，
4000rpm
离心
10min
，弃去上清，然后加入
1ml
的
pbs
洗涤一次，
4000rpm
离心
10min
后，沉淀用
ph
＝
2.5
的
mrs
培养基重悬
。37℃
孵育
3h
，分别在
0h
和
3h
取样
。
样品离心后用
pbs
重悬并梯度稀释，稀释后的样品涂布在
mrs
琼脂平板上，于
37℃
厌氧培养
16h
后进行菌落计数
。
存活率计算公式为：耐酸存活率
(
％
)
＝
c1/c0
×
100
％
(c0
：
0h
计数结果；
c1
：
3h
计数结果
)。
对照菌株为鼠李糖乳杆菌
gg。
[0075]
经酸性培养基培养3小时后，对照菌株鼠李糖乳杆菌
gg
的存活率为
84.56
％，植物乳杆菌
dt88
的存活率为
62.53
％
(
图
3)
，与对照菌株相比没有显著差异，能够在胃部环境中存活
。
[0076]
实施例3植物乳杆菌
dt88
的耐胆盐能力检测
[0077]
细菌经胃部进入肠道后，小肠中的高浓度胆盐会杀死细菌
。
食物在小肠中的停留时间一般为1～
4h。
[0078]
因此，本实施例使用
0.1
％胆盐-mrs
培养基来验证植物乳杆菌
dt88
菌株的耐胆盐性能
。
将植物乳杆菌
dt88
菌液接种于含有
mrs
培养基的
96
深孔板中，
37℃
厌氧培养
24h。
取
300
μ
l
培养后菌液，
4000rpm
离心
10min
，弃去上清，加入
600
μ
l
含
0.1
％胆盐的
mrs
培养基，重悬混匀
。
对照组取
100
μ
l
重悬液，加入
20
μ
l mtt(
噻唑蓝
)
溶液；处理组取
100
μ
l
重悬液，
37℃
孵育
4h
后，再加入
20
μ
l mtt
溶液
。
加入
mtt
溶液后
37℃
避光反应
4h
，反应结束后
4000rpm
离心
10min
，弃去上清
。
每孔加入
100
μ
l dmso
溶液，
37℃
，振荡孵育
10min
，使反应生成的蓝紫色甲臜完全溶解混匀
。
混匀后用酶标仪测定溶液
570nm
处吸光度，计算存活率
。
存活率＝
a1/a0
×
100
％
(a1
：处理组溶液在
570nm
处吸光值，
a0
：对照组溶液在
570nm
处吸光值
)。
用相同方法测定对照菌株鼠李糖乳杆菌
gg
的存活率
。
[0079]
经
0.1
％胆盐-mrs
培养基培养4小时后，对照菌株鼠李糖乳杆菌
gg
的存活率为
101.5
％，植物乳杆菌
dt88
的存活率为
100.9
％
(
图
4)。
这表明植物乳杆菌
dt88
与对照菌株鼠李糖乳杆菌
gg
耐胆盐能力相当，能够在小肠中存活
。
[0080]
实施例4植物乳杆菌
dt88
吸附微塑料的效果测定
[0081]
将植物乳杆菌
dt88
接种到
mrs
培养基中，
37℃
厌氧培养
24h。
培养后的菌液经
4000rpm
离心
10min
，弃去上清，加入
450
μ
l
的无菌
pbs
缓冲液洗涤2次
。
然后加入
pbs
重悬，调整菌液浓度为1×
109cfu/ml。
实验组取植物乳杆菌
dt88
菌悬液
100
μ
l
到
1.5ml ep
管中，加入
900
μ
l
的
ps
荧光微球工作液
(0.16mg/ml
，粒径
0.1
μm，倍思乐公司
)
混匀，置于摇床避光振荡孵育
4h
，孵育条件为
37℃
，
800rpm。
空白对照组取
100
μ
l pbs
和
900
μ
l ps
荧光微球工作液到
1.5ml ep
管中混匀孵育
。
菌液对照组取
100
μ
l
植物乳杆菌
dt88
菌悬液和
900
μ
l pbs
到
1.5ml ep
管中混匀孵育
。
孵育结束后，取孵育液观察拍照，结果见图
5。
[0082]
取实验组和空白对照组孵育液，
2000rpm
离心
10min
，取
100
μ
l
的上清，利用酶标仪测定荧光强度
。
酶标仪参数为：激发波长：
494nm
；检测波长：
518nm。
根据荧光强度数值计算吸附率
。
对照菌株为同批次筛选实验中筛选得到的另一株植物乳酸杆菌，用相同的方式测定对照菌株的吸附率，结果见图
6。
吸附率计算公式为：吸附率
(
％
)
＝
(a1-a2)/a1
×
100
％
(a1
：空白对照组荧光值，
a2
：植物乳杆菌组荧光值
)。
取离心后沉淀，采用戊二醛于
4℃
固定过夜，再采用乙醇进行梯度脱水，烘干后用电子显微镜观察，结果见图
7。
[0083]
从图5可以看出，空白对照组中，
ps
荧光微球不会自凝集；菌液对照组中，植物乳杆菌
dt88
不会自凝集；实验组中，植物乳杆菌
dt88
与
ps
荧光微球出现特异性吸附凝集絮状物
。
[0084]
从图6可以看出，对照菌株的吸附率为
8.03
％，微塑料吸附能力较差，而植物乳杆菌
dt88
的吸附率达到
79.78
％，具有很强的吸附微塑料能力
。
这表明，植物乳杆菌
dt88
对微塑料的吸附效果具有菌株特异性
。
[0085]
从图7可以看出，在电子显微镜观察下，植物乳杆菌
dt88
表面吸附了球状的
ps
荧光微球
。
[0086]
实施例5植物乳杆菌
dt88
的抗氧化能力测定
[0087]
将植物乳杆菌
dt88
接种到
mrs
培养基中，
37℃
厌氧培养
24h。
培养后的菌液经
4000rpm
离心
10min
，弃去上清，加入
450
μ
l
的无菌
pbs
缓冲液洗涤2次，调整菌液浓度为1×
109cfu/ml。
实验组取
500
μ
l
菌悬液加入
500
μ
l 0.2mmol/l
的
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼
(dpph)
乙醇溶液
。
抗氧化剂维生素
c(vc)
用作阳性对照，取
500
μ
l 3
μ
g/ml
维生素溶液，加入
500
μ
l 0.2mmol/l
的
dpph
乙醇溶液
。
对照组取
500
μ
l pbs
加入
500
μ
l 0.2mmol/l
的
dpph
乙醇溶液
。
空白组取
500
μ
l
菌悬液加入
500
μ
l
无水乙醇溶液
。
混匀后置于
30℃
摇床避光振荡反应
30min。
振荡结束后取反应液
4000rpm
离心
10min
，取
100
μ
l
上清用酶标仪在
517nm
处测定吸光度
。
计算
dpph
自由基清除率
。
计算公式为：
dpph
清除率
(
％
)
＝
[1-(as-a0)/ai]
×
100
％
(as:
实验组荧光值；
a0:
空白组荧光值；
ai:
对照组荧光值
)。
[0088]
从图8可以看出，抗氧化剂维生素c对
dpph
的清除率为
60.90
％，与维生素c类似，植物乳杆菌
dt88
具有一定的抗氧化能力，对
dpph
的清除率为
35.36
％
。
因此，定植植物乳杆菌
dt88
可以降低微塑料给宿主带来的氧化损伤
。
[0089]
综上所述，本发明分离筛选获得了一株植物乳杆菌
dt88。
该菌株耐酸
、
耐胆盐，具有在胃部和小肠定植的能力，可以应用于食用益生菌开发
。
植物乳杆菌
dt88
具有很强的吸附微塑料能力，实验数据也证明了该菌株具有抗氧化能力
。
由此可见，植物乳杆菌
dt88
是一株适于消化道环境的菌株，在吸附微塑料
、
加速微塑料排出及降低微塑料带来的氧化损伤方面具有广阔的应用前景
。
[0090]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围
。