一株韩国青霉及其应用-华体会hth(中国)官方网站

1.本发明涉及微生物技术领域，株韩具体涉及一株韩国青霉及其应用。国青


背景技术：

2.植物寄生线虫引起作物的霉及病害日趋严重，因它的株韩隐蔽性，使其防治困难，国青同时因为高毒高残留的霉及化学杀线虫剂对人畜健康和环境有很大的为害，因此，株韩生产上亟待寻找化学防治的国青替代方法。微生物防治资源种类有很多，霉及主要包括：天敌真菌、株韩天敌细菌、国青天敌放线菌以及其他线虫天敌生物等。霉及线虫天敌真菌分布非常广泛，株韩在植物寄生线虫的国青生物防治研究中已经有了很多的报道。全世界己报道的霉及线虫寄生真菌150余种，我国报道20余种，主要包括普奇尼亚属(pochonia)、拟青霉属(paecilomyces)、钩丝孢属(harposporium)、被毛孢属(hirsutella)、毒虫霉属(nematoctonus)、串孢壶菌属(myzocytium)和掘氏梅里霉属(drechmeria)等(李天飞等，2000；李娟等，2013)。以淡紫拟青霉为活性成分研制杀线虫制剂，已应用在生产上防治香蕉、马铃薯、烤烟以及柑橘等重要经济农作物的病原线虫；菲律宾亚州技术中心、美国拜耳公司等将该菌制成商品化制剂biocon、paecil(li et al.,2015)。
3.植物寄生线虫病害的防治主要依赖化学杀线剂，但杀线剂多为高毒、高残留药剂，杀死土壤中植物寄生线虫的同时，也杀死了有益生物，严重破坏生态平衡，污染环境，威胁人类的健康。而生物防治被广泛认为是一种有前景的防病途径，因此，获得对植物寄生线虫具有高毒力的生防菌株，对开发新型杀线虫生物源农药具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一株韩国青霉，本发明的韩国青霉为从土壤中分离，对土壤环境适应性强的，该菌的代谢产物具有明显的杀线虫活性物质，可用于根结线虫、孢囊线虫和根腐线虫等的生物防治。
5.为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
6.一株韩国青霉，命名为韩国青霉penicillium koreense gx2，于2021年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.40001，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7.如上所述韩国青霉gx2在防治线虫方面的应用。
8.如上所述韩国青霉gx2的代谢产物在防治线虫方面的应用。
9.包含如上所述韩国青霉gx2代谢产物的制剂，用于防治线虫。
10.作为优选，所述的线虫为根结线虫、孢囊线虫和根腐线虫。
11.作为优选，所述的线虫为南方根结线虫、象耳豆根结线虫、大豆孢囊线虫、玉米孢囊线虫或根腐线虫。
12.作为优选，所述韩国青霉gx2的代谢产物制备方法为将韩国青霉penicillium koreense gx2在pda平板上培养5-7天，将培养所得菌落打成菌饼，接种到查彼克培养基中，
接种量为1个菌饼，26℃，150r/min振荡发酵培养1周到3周(即7天至21天)，取发酵滤液原液，即为韩国青霉p.koreense gx2的代谢产物。
13.作为优选，将培养所得菌落打成菌饼，接种到查彼克培养基中，接种量为1个菌饼，26℃，150r/min振荡发酵培养2周(即14天)。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果：
15.本发明从土壤中分离筛选出一株韩国青霉penicillium koreense gx2，该菌对孢囊线虫有很好的寄生作用，同时其代谢产物对孢囊线虫和根结线虫二龄幼虫及卵有很好毒杀效果，是对植物寄生线虫具有高毒力的生防菌株，不但丰富植物寄生线虫生防菌资源，更重要的是对开发杀线虫绿色农药或药肥具有十分重要的意义。
16.保藏信息说明
17.韩国青霉penicillium koreense gx2于2021年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.40001。
附图说明
18.图1是韩国青霉penicillium koreense gx2的形态学特征；其中，a：菌落形态，上排左至右：正面cya、mea、yes、oa；下排左至右：反面cya、mea、yes、正面pda；b-h：分生孢子梗和分生孢子；i：分生孢子；比例尺：b-g＝20μm，h＝100μm。
19.图2是韩国青霉penicillium koreense gx2基于its-bena-cam-rpb2序列构建的ml系统发育树。
20.图3是韩国青霉penicillium koreense gx2寄生玉米孢囊线虫的孢囊；其中，a-b：孢囊被penicillium koreense gx2寄生情况(表面消毒后孢囊转移到pda平板培养的第3d)；c：对照组孢囊(没有任何菌寄生)；比例尺＝200μm。
具体实施方式
21.下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。实施例中使用的南方根结线虫、象耳豆根结线虫、大豆孢囊线虫、玉米孢囊线虫均为本实验室培养所得。
22.查彼克培养基：nano
3 2.00g，kcl 0.50g，feso
4 0.01g，k2hpo
4 1.00g，mgso
4 0.50g，蔗糖30.0g，溶解至水1000ml蒸馏水中，用玻棒不断搅拌，充分溶解后均等分装入10个250ml三角瓶中，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟，备用。
23.20％的查彼克培养基为采用灭菌水将查彼克培养基稀释至质量浓度为20％后所得。
24.cya(查氏酵母膏琼脂)：nano
3 3.0g，kh2po
4 1.0g，kcl 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g，酵母膏5.0g，蔗糖30.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml。
25.yes(酵母提取物蔗糖琼脂培养基)：酵母膏20g，sucrose 150g，七水硫酸镁0.5g，迹量盐溶液(feso4.7h2o 0.1g mncl2.4h2o 0.1g)，琼脂20g，蒸馏水885ml，充分混匀高压灭菌121℃，for 15min，ph 6.5
±
0.2。
26.mea(麦芽汁浸膏琼脂培养基)：麦芽浸膏(oxoid cm0059)50g，迹量盐溶液1ml，蒸馏水1000ml，充分混匀高压灭菌121℃for 10min，ph5.4
±
0.2。
27.oa(燕麦琼脂培养基)：燕麦粉浸液30g，迹量盐溶液1ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph 6.5
±
0.2。
28.pda：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
29.实施例1
30.菌株的筛选和分离
31.本发明的韩国青霉penicillium koreense是土壤中分离筛选出，土壤样品采自中国广西来宾市兴宾区感染玉米孢囊线虫的玉米地，采取z字形取样法采集土样，去除植株根围1-2cm表土，取土壤样品；采用淘洗过筛法分离土壤中线虫的孢囊，滤纸片保湿培养法，将长出菌丝孢囊转移到pda平板中培养，进一步分离纯化得到不同菌株，再分别进行寄生能力等活性验证，得到寄生率高的菌株，该菌株编号为gx2。
32.该真菌菌株在pda平板培养的形态如图1，经dna提取，根据青霉属的保守区域，分别扩增its、bena、cam和rpb2基因片断，genebank数据库比对，mega 7.0分析，鉴定该菌株为韩国青霉penicillium koreense，命名为penicillium koreense gx2(简称p.koreense gx2)。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmcc no.40001。
33.penicillium koreense gx2菌株形态学鉴定
34.如图1所示，图为penicillium koreense gx2在pda平板培养的形态如图1，分生孢子梗产生于表面菌丝，孢梗茎200-400μm
×
3-4μm，壁光滑；帚状枝双轮生、单轮生兼不规则生；梗基4-8个每轮，排列不紧密，10-15μm
×
2.5-4μm；瓶梗安瓿形，排列不紧密，每轮4-6个，10-12μm
×
2-3μm；分生孢子近球形至椭球形，2.5-3.5μm
×
2-3μm，壁光滑。
35.在查氏酵母膏琼脂(cya)上25℃、7d，菌落直径27-32mm，分生孢子结构较少，菌丝体为白色，中央微凸起，向外形成明显的辐射状沟纹。
36.在麦芽汁浸膏琼脂培养基(mea)上25℃、7d，菌落直径40-52mm，较薄，边缘较规整；质地绒毛状；无分生孢子，菌丝体浅白色微黄；无渗出液；无可溶性色素；菌落背面白色夹杂淡黄色。
37.在酵母提取物蔗糖琼脂培养基(yes)上25℃、7d，菌落直径32-35mm，较厚，边缘规整；质地短绒状；无分生孢子结构，无可溶性色素；菌落背面呈白色。
38.在燕麦琼脂培养基(oa)上25℃、7d，菌落直径28-35mm，分生孢子结构较多，暗绿色；无可溶性色素。
39.在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上25℃、7d，菌落直径30-34mm，边缘规整，菌落中央青绿色；分生孢子结构较多，暗绿色；无渗出液；无可溶性色素。
40.菌株分子生物学鉴定
41.根据青霉属的保守区域，分别扩增its、bena、cam和rpb2基因片断，其中its 560bp，bena 450bp，cam 533bp，rpb2 998bp。genbank登录号(its＝om835901，bena＝on113876，cam＝om836794，rpb2＝on113877)。选择青霉属38个物种的模式菌株及本发明gx2共39株青霉菌，用mega7.0进行对位排列并编辑修剪后做成序列矩阵，构建its-bena-cam-rpb2多基因联合系统发育树。系统发育树结果表明(图2)，本发明中的gx2与
penicillium koreense kacc 47721聚在一支，序列系统发育树的支持率为100％。结合形态学特征和分子序列分析结果，将菌株gx2鉴定为penicillium koreense，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmcc no.40001。
42.韩国青霉penicillium koreense gx2寄生玉米孢囊线虫
43.将玉米孢囊线虫的孢囊放在上述penicillium koreense gx2的菌落边缘培养3天，每皿10个孢囊，3次重复。以消毒孢囊放置到未接真菌的pda平板上作为对照。待菌丝覆盖孢囊后，将孢囊轻轻挑出(注意不要弄破孢囊)，用0.5％ naocl进行表面消毒3min，再用灭菌水清洗3次，对照组做同样的处理。随后将表面消毒孢囊逐个转移到pda平板上，每皿5个，共6皿，于25℃恒温培养箱进行培养。从玉米孢囊线虫的孢囊重新长出中间绿边缘白的菌落，计算孢囊寄生率(寄生率(％)＝寄生孢囊数/试验孢囊总数
×
100％)，该试验重复3次。经鉴定是penicillium koreense gx2，孢囊被penicillium koreense gx2寄生(图3a、b)，寄生率为93.33％，而对照组始终没有任何菌寄生(图3c)，说明penicillium koreense gx2对孢囊线虫有很好的寄生作用。
44.实施例2
45.制备韩国青霉penicillium koreense gx2的代谢产物
46.将韩国青霉penicillium koreense gx2在pda平板上培养5-7天，然后将培养所得菌落用打孔器(直径为0.9mm)打成菌饼，所得菌饼接种到装有100ml查彼克培养基的三角瓶(250ml)中，接种量为1个菌饼，26℃，150r/min分别振荡发酵培养，每周放进3瓶(三个重复)，3周后同时取发酵1周、2周和3周的发酵液，用0.22μm细菌过滤器过滤发酵液得到发酵滤液原液，即为韩国青霉p.koreense gx2的代谢产物。分别得到韩国青霉p.koreense gx2发酵1周的代谢产物、发酵2周的代谢产物和发酵3周的代谢产物，用于杀线虫试验。
47.实施例3
48.对象耳豆根结线虫j2的毒杀作用
49.实施例2中菌株p.koreense gx2发酵2周的代谢产物对象耳豆根结线虫j2有显著的毒杀效果：将实施例2所得p.koreense gx2发酵2周的代谢产物用灭菌水分别配制成5％、10％、20％、50％体积浓度的代谢产物，分别加入到无菌96孔细胞培养板中。将当天孵化的象耳豆根结线虫j2加入96孔细胞培养板中，每孔约60条。以20％查彼克培养基和灭菌水作对照，每个处理浓度重复4次。将96孔细胞培养板置于25℃恒温培养箱中，然后分别在24、48、72h于显微镜下镜检各处理中线虫的死亡情况，线虫死亡的判定标准：线虫僵直，且用毛针刺激后不活动，说明线虫死亡。结果显示10％浓度发酵2周的代谢产物处理48h，根结线虫死亡率达100％(表1)。
50.表1p.koreense gx2发酵2周的代谢产物处理象耳豆根结线虫j2的致死率(％)
[0051][0052]
注：数据为平均值
±
标准误。同列数值后的不同字母表示根据duncan新复极差法检验在p《0.05水平显著差异。
[0053]
实施例4
[0054]
对大豆孢囊线虫j2的毒杀作用
[0055]
采用实施例2菌株p.koreense gx2发酵2周的代谢产物对大豆孢囊线虫j2的毒杀：处理方式同实施例3，结果显示：浓度为50％和40％的p.koreense gx2发酵两周的代谢产物，在处理第72h对大豆孢囊线虫j2的致死率为86.53％和84.91％，死亡线虫均呈现僵直状态。
[0056]
表2p.koreense gx2发酵2周的代谢产物对大豆孢囊线虫j2致死率(％)
[0057][0058]
实施例5
[0059]
对玉米孢囊线虫j2的毒杀作用
[0060]
采用实施例2菌株p.koreense gx2发酵2周的代谢产物对玉米孢囊线虫j2的毒杀：
处理方式同实施例3，试验过程发现，在处理24、48和72h时各浓度发酵2周的代谢产物中，线虫的死亡率均显著高于对照，其中在处理第72h，浓度为20％和50％的p.koreense gx2发酵2周的代谢产物对玉米孢囊线虫j2的致死率达98.06％和98.46％，显著高于对照组(p《0.05)(表3)。
[0061]
表3p.koreense gx2发酵2周的代谢产物对玉米孢囊线虫j2致死率(％)
[0062][0063][0064]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。